临床肝胆病杂志

基金项目: 

国家自然科学基金面上项目(81373465)； 湖南省自然科学省市联合基金(2016JJ5010)； 湖南省卫生计生委科研课题(A2017015)； 

目的设计并构建针对ECEL1基因的RNA干扰慢病毒载体。方法依照ECEL1基因为模板,设计RNA干扰靶点,根据选定的靶点序列,设计短发夹RNA（shRNA）干扰序列,在两端添加相应的限制性内切酶酶切位点,合成单链DNA oligo,退火缓冲液中配对形成双链DNA oligo。利用Age I和EcoR I双酶线性化GV115载体。把载体和DNA oligo相连接,其连接产物转化大肠杆菌感受态细胞,经PCR扩增并测序鉴定。再通过质粒抽提,转染,浓缩与纯化后获得重组的ECEL1基因RNAi慢病毒,用"HIV-1p24抗原ELISA法"测定样品滴度。选取检测合格的慢病毒感染人肝癌细胞（BEL-7404）,并设置对照组,荧光观察感染率。并使用Real-time PCR法及Western blot检测人肝癌细胞（BEL-7404）中ECEL1基因敲减后mRNA和蛋白质的表达量。2组间比较采用两独立样本t检验。结果 （1）根据ECEL1基因模板设计后,选定psc48784片段作为RNA干扰靶点,制备双链DNA oligo,PCR鉴定阳性重组子并测序,验证psc48784为正确的克隆。经过质粒抽提,转...

来源：2019年第6期

《临床肝胆病》期刊编辑部

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